グリオキサラーゼＩ活性を阻害するアポトーシス誘導剤
【課題】ＧＳＨを基本骨格としない新規な骨格を有するグリオキサラーゼＩ活性阻害剤およびアポトーシス誘導剤を提供すること。
【解決手段】特定のファーマコフォアを有する化合物を含むグリオキサラーゼＩ活性阻害剤、およびそのグリオキサラーゼＩ阻害作用に基づくアポトーシス誘導剤。
【解決手段】特定のファーマコフォアを有する化合物を含むグリオキサラーゼＩ活性阻害剤、およびそのグリオキサラーゼＩ阻害作用に基づくアポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なグリオキサラーゼＩ活性阻害剤に関する。さらに詳細には、本発明はグリオキサラーゼＩ活性を阻害するアポトーシス誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリオキサラーゼＩ（ＧＬＯ Ｉ）は、メチルグリオキサール（ＭＧ）とグルタチオン（ＧＳＨ）からＳ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンを生成させる酵素である。その後、Ｓ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンはグリオキサラーゼＩＩ（ＧＬＯ ＩＩ）により乳酸へと代謝される（式１参照）。ＭＧは解糖系の代謝副産物であるが、反応性の高いジカルボニル化合物であることから、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡを非可逆的に修飾し、細胞死（アポトーシス）を誘発する。よって、ＧＬＯ Ｉは細胞内で毒性の強いＭＧを乳酸へと無毒化する役割を担っている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
これまでの研究では、ＧＬＯ Ｉは大腸及び前立腺癌細胞等に過剰に発現しており、また、抗癌剤に耐性を示す細胞株においても高発現していることが報告されている（非特許文献１〜３）。以上のことから、ＧＬＯ Ｉ活性を阻害する薬剤は、癌細胞にＭＧを蓄積させ、アポトーシスを誘導するという新しいタイプの抗癌剤として注目されており、これまでにいくつかのＧＳＨ類縁体が開発されている（非特許文献４）。
しかしながら、ＧＳＨ誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては強いＧＬＯ Ｉ阻害活性を示すが、ＧＳＨが持つペプチド骨格、特に負電荷を持つ２つのカルボキシル基（式２参照）が膜透過性、吸収性、安定性に影響を与え、医薬品のリード化合物としては不適切であると考えられている。
【０００５】
【化２】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＳＤ， Ｃｈｅｒｒｙ ＪＰ， Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ＭＳ， Ｔａｚａｋｉ Ｈ， Ｍａｌｌｏｕｈ Ｃ， Ｋｏｎｎｏ Ｓ． Ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ Ｕｒｏｌ． （１９９９） １６１， ６９０−６９１
【非特許文献２】Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ Ｓ， Ｗａｌｓｈ ＥＳ， Ｔｅｗ ＫＤ． Ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ ｉｎ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ： ｓｔｕｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． （１９９５） ３０９， １２７−１３１
【非特許文献３】Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ， Ｍａｓｈｉｍａ Ｔ， Ｋｉｚａｋｉ Ａ， Ｄａｎ Ｓ， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｙ， Ｎａｉｔｏ Ｍ， Ｔｓｕｒｕｏ Ｔ． Ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｂｌｏｏｄ． （２０００） ９， ３２１４−３２１８
【非特許文献４】Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ ＤＪ， Ｚｈｅｎｇ ＺＢ， Ｈｏｌｅｗｉｎｓｋｉ Ｒ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＤＳ， Ｅｉｓｅｍａｎ ＪＬ． Ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ． （２００３） ３１， １３７８−１３８２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような背景から本発明者らは、ＧＬＯ Ｉ活性阻害剤としてＧＳＨを基本骨格として有していない新規な低分子化合物が必要とされていると考え、ＧＬＯ Ｉ活性を阻害しかつ上記問題点を改善可能なアポトーシス誘導剤を提供することを本発明の目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、ＧＬＯ Ｉの特定の４つの結合ポケット（図１、Ｓ１〜Ｓ４）との結合領域を有する化合物がＧＬＯ Ｉ活性を有意に阻害しかつアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。なお、ファーマコフォアの定義においては通常の構造式の結合は破線で示してある。
（１） 以下のファーマコフォア
【０００８】
【化３】
【０００９】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、あるいは、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕
を有する化合物またはその配糖体を少なくとも一種含有する、グリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
（２） 以下の式（Ｉ−ａ）または（Ｉ−ｂ）
【００１０】
【化４】
【００１１】
〔式中、Ｒ１１はＣ１−６アルコキシまたは水素であり；Ｒ１２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ１４はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、水素またはハロゲンであり；Ｒ１８は、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシまたは水素であり；点線部は任意で単結合であり、点線部に単結合がある場合、Ｘ１は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ１９−（Ｒ１９は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基であり、点線部に結合が存在しない場合、Ｘ１は水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｘ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ１９−（Ｒ１９は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基である〕で示される化合物、および
式（ＩＩ）
【００１２】
【化５】
【００１３】
〔式中、Ｒ２１はオキソ、アリールまたは水素であり；Ｒ２２はアリール、含窒素複素環基、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アリール−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルまたは水素であるか；またはＲ２１とＲ２２は各基が結合する５員環上の原子と一緒になって、芳香族環、Ｃ３−６シクロアルカン、Ｃ３−６シクロアルケンを形成し；Ｒ２３はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ２４は置換されていてもよいアリールであり；Ｙ、Ｚは独立してそれぞれ窒素または炭素であり；Ｗは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＣＨ２−、−ＮＲ２５−（Ｒ２５は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基であるか、または結合であるか、あるいはＺが炭素であるときＷが＝ＣＨ−であり；
【００１４】
【化６】
【００１５】
は、Ｙ、Ｚ、Ｗの種類に依存して単結合もしくは二重結合を示す〕で示される化合物、ならびに
それらの配糖体からなる群から選択される化合物を含有する、グリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
（３） Ｒ１２がヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、またはＣ１−６アルキル−カルボキシであり；Ｒ１３がヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシまたは水素であり；Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７がそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリルまたは水素であり；点線部が単結合である場合、Ｘ１が−Ｏ−であり、点線部に結合が存在しない場合、Ｘ１が水素であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；
Ｒ２２がアリール、アリール−Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６アルコキシ−カルボニルであるか、またはＲ２１とＲ２２が各基が結合する５員環上の原子と一緒になって、Ｃ３−６シクロアルケンを形成し；Ｒ２３がヒドロキシであり；Ｙが炭素であり；Ｚが窒素でありかつＷが−ＣＨ２−または結合であるか、あるいはＺが炭素でありかつＷが＝ＣＨ−である、上記（２）に記載のグリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
（４） アポトーシス誘導剤である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のグリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
（５） 以下の式（ＩＩＩ）
【００１６】
【化７】
【００１７】
〔Ｒ３１はヒドロキシ、アリール、アリールオキシ、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルケニルオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ３３はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、水素またはハロゲンである〕で示される化合物またはその配糖体。
（６） Ｒ３１がヒドロキシ、アリールオキシ、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシまたはＣ１−６アルケニルオキシであり；Ｒ３２がヒドロキシであり；Ｒ３３がヒドロキシであり；Ｒ３４、Ｒ３５およびＲ３６のいずれか１つが水素であり、残りの２つがヒドロキシである、上記（５）に記載の化合物またはその配糖体。
（７） Ｒ３１がアリールオキシである、上記（６）に記載の化合物またはその配糖体。
（８） 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【００１８】
【化８】
【００１９】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、グリオキサラーゼＩ活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
（９） 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【００２０】
【化９】
【００２１】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕に合致するかどうかを調べる工程と
合致した化合物のグリオキサラーゼＩ活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【００２２】
以下の説明において、上記ファーマコフォアを有する化合物、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで示される化合物を総合してＧＬＯ Ｉ活性阻害化合物とも表し、また、該化合物またはその配糖体を含有するＧＬＯ Ｉ阻害剤およびアポトーシス誘導剤を単に本発明の薬剤と表することもある。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の薬剤は、ＧＬＯ Ｉ阻害剤としては新規な骨格を有する化合物を有効成分とするため、従来のＧＳＨ誘導体に見られるようなＧＳＨが持つペプチド骨格、特に負電荷を持つ２つのカルボキシル基による膜透過性、吸収性、安定性への影響がない点で有用であり、医薬品のリード化合物としてもＧＳＨ誘導体よりも適切である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本明細書におけるＣ１−６アルキルとは、炭素数１〜６の直鎖または分枝のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘキシルなどが挙げられる。
本明細書におけるＣ１−６アルコキシとは、炭素数１〜６の直鎖または分枝のアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ、ｔｅｒｔ−ヘキシルオキシなどが挙げられる。
本明細書におけるＣ１−６アルケニルとは、炭素数１〜６の直鎖または分枝のアルケニル基を意味し、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキサニレンなどが挙げられる。
本明細書におけるハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などが挙げられる。
本明細書におけるアリールとは、１〜３員の芳香族基を意味し、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニルなどが挙げられる。
本明細書における置換されていてもよいアリールの置換基としては、例えば、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロおよびハロゲンが挙げられるが、なかでもニトロおよびハロゲンが好ましい。
本明細書における含窒素複素環基とは、少なくとも１つ以上の窒素原子を環構成原子として含む単環系または縮合環系の複素環基を意味し、例えば、ピロリニル、イミダゾリニル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリジニル、カルバゾリニルなどが挙げられる。
本明細書における芳香族環とは、単環系および縮合環系の芳香族環を意味し、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセンなどが挙げられる。
本明細書におけるＣ３−６シクロアルカンとは、炭素数３〜６の脂肪族シクロアルカンを意味し、例えば、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサンなどが挙げられる。
本明細書におけるＣ３−６シクロアルケンとは、炭素数３〜６の脂肪族シクロアルケンを意味し、例えば、シクロプロペン、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセンなどが挙げられる。
本明細書における置換されていてもよいアリルの置換基としては、置換されていてもよいアリールの置換基として例示したようなものが挙げられるが、なかでもＣ１−６アルキルが好ましい。
【００２５】
Ｒ１としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）または水素が好ましい。
Ｒ２としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）、アリール（特にフェニル）またはＣ１−６アルキル−カルボキシ（特にメチルカルボキシ）が好ましい。
Ｒ３としては、−Ｏ−または水素が好ましい。
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）、ハロゲン（特に塩素）、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ（特にメチルカルボキシ）、置換されていてもよいアリル（特に１，１−ジメチルアリル）、ニトロまたは水素が好ましい。
Ｒ１１としては、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）または水素が好ましい。
Ｒ１２としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）またはＣ１−６アルキル−カルボキシ（特にメチルカルボキシ）が好ましい。
Ｒ１３としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）または水素が好ましい。
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ（特にメチルカルボキシ）、置換されていてもよいアリル（特に１，１−ジメチルアリル）または水素が好ましい。
Ｘ１としては、点線部が単結合である場合、−Ｏ−が好ましく、点線部に結合が存在しない場合、水素が好ましい。
Ｘ２としては、−Ｏ−が好ましい。
Ｒ２２としては、アリール（特にフェニル）、アリール−Ｃ１−６アルキル（特にフェニルメチル）またはＣ１−６アルコキシ−カルボニル（特にエトキシカルボニル）が好ましい。
また、Ｒ２１とＲ２２が、各基が結合する５員環上の原子と一緒になって、シクロヘキセンを形成するのも好ましい。
Ｒ２３としては、ヒドロキシが好ましい。
Ｒ２４としては、フェニル、クロロフェニルまたはクロロニトロフェニルが好ましい。
Ｙとしては、炭素が好ましい。
Ｚが窒素であるときＷとしては−ＣＨ２−または結合が好ましく、Ｚが炭素であるときＷとしては＝ＣＨ−が好ましい。
Ｒ３１としては、ヒドロキシ、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ（特にメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、フェノキシ、フェニルメトキシ）、Ｃ１−６アルケニルオキシ（特に２−メチルプロペニルオキシ）が好ましい。
Ｒ３２としては、ヒドロキシが好ましい。
Ｒ３３としては、ヒドロキシが好ましい。
Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６としては、ヒドロキシまたは水素が好ましい。
【００２６】
本発明の薬剤の有効成分として用いる化合物としては、下記の式で表されるフラボン骨格、カルコン骨格、オーロン骨格を有する化合物、および上述の式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）で示される化合物、ならびにそれらの配糖体が好ましい。
【００２７】
【化１０】
【００２８】
フラボン骨格を有する化合物としては、特に、ルテオリン、バイカレイン、３−ａｃｏ−２−（３，４−ジアセトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル酢酸、アピゲニン、ケルセチン、ケンフェロール、オロキシリンＡ、ラムネチン、アカセチン、オウゴニンが好ましい。
【００２９】
フラボン骨格を有する化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよいが、例えば、マメ科、アヤメ科、バラ科等に属する植物から、慣用の抽出精製方法を用いて遊離化合物または配糖体として得ることができる。
【００３０】
例えば、オロキシリンＡおよびオウゴニンは、以下のようにして得ることができる。
オウゴン（４５０ｇ）をエタノールで抽出し、得られたエタノールエキスに水を加え、エチルエーテルで分配する。エーテル層をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０を担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ベンゼン−アセトンの混液で溶出させ、３画分（ｆｒ．１、ｆｒ．２、ｆｒ．３）を得る。このうちｆｒ．１をさらにシリカゲルを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ベンゼンで溶出させ、オロキシリンＡ（２０ｍｇ）およびオウゴニン（４０ｍｇ）を得る。
【００３１】
また、天然に見出されていない本発明のフラボン骨格を有する化合物については、例えば、天然から単離され得るフラボン骨格を有する化合物を、慣用の方法を用いて改変することにより調製することができる。
【００３２】
カルコン骨格を有する化合物としては、特に、３，４，４’，６’−テトラヒドロキシ−６−メトキシカルコン、リコカルコンＡ、リコカルコンＢが好ましい。
【００３３】
カルコン骨格を有する化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよいが、例えば、キク科植物等から、慣用の抽出精製方法を用いて遊離化合物または配糖体として得ることができる。
【００３４】
例えば、リコカルコンＡおよびＢは、市販の新彊産甘草を７０％含水アセトン中でホモジナイズし、遠沈で不溶物を除いた後、上清の濃縮物をエーテルと水で分配、エーテルエキスについて遠心向流分配クロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール−水７：１３：８；下降法）およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール９８：２で溶出）を組み合わせて分離することにより、それぞれ黄色結晶として得ることができる。
【００３５】
また、３，４，４’，６’−テトラヒドロキシ−６−メトキシカルコンは、例えば、東北甘草を上記と同様含水アセトン抽出し、そのエーテルエキスについて液滴向流分配クロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール−プロパノール−水４５：６０：１０：４０；下降法）、ＭＣＩ−ゲル ＣＨＰ−２０Ｐを吸着剤とするカラムクロマトグラフィー（含水メタノールで溶出）およびシリカゲル薄層での分取クロマトグラフィーを組み合わせて分離することにより、リコカルコンＢ、グリシクマリンとともに、黄色結晶として得ることができる。
【００３６】
また、天然に見出されていない本発明のカルコン骨格を有する化合物については、例えば、天然から単離され得るカルコン骨格を有する化合物を、慣用の方法を用いて改変することにより調製することができる。
【００３７】
オーロン骨格を有する化合物としては、特に、スルフレチンが好ましい。
【００３８】
オーロン骨格を有する化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよいが、例えば、キク科植物等から、慣用の抽出精製方法を用いて遊離化合物または配糖体として得ることができる。
【００３９】
例えば、スルフレチンは、Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ社（フランス）から入手することができる。
【００４０】
また、天然に見出されていない本発明のオーロン骨格を有する化合物については、例えば、天然から単離され得るオーロン骨格を有する化合物を、慣用の方法を用いて改変することにより調製することができる。
【００４１】
式（ＩＩ）で示される化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよく、適宜慣用の合成法を組み合わせて合成してもよいし、市販のものであってもよい。
【００４２】
式（ＩＩ）で示される化合物としては、特に、２−（４−クロロ−３−ニトロベンジリデン）−４−ヒドロキシ−５−フェニルシクロペント−４−エン−１，３−ジオン、１，４−ジベンジル−３−ヒドロキシ−１Ｈ−ピロール−２（５Ｈ）−オン、１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−２，４，５，６−テトラヒドロ−２−インドロン、エチル ４−ヒドロキシ−５−オキソ−１，２−ジフェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−カルボキシレートが好ましい。
【００４３】
式（ＩＩ）で示される化合物のうち好ましい化合物は、例えば、２−（４−クロロ−３−ニトロベンジリデン）−４−ヒドロキシ−５−フェニルシクロペント−４−エン−１，３−ジオンはＲａｒｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ社（カタログナンバー：ＢＢＲＢ１５７２）、１，４−ジベンジル−３−ヒドロキシ−１Ｈ−ピロール−２（５Ｈ）−オンはＴｉｍＴｅｃ社（カタログナンバー：ＳＴ２０９８１７）、１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−２，４，５，６−テトラヒドロ−２−インドロンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（カタログナンバー：Ｓ７６０６８４）、エチル ４−ヒドロキシ−５−オキソ−１，２−ジフェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−カルボキシレートはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（カタログナンバー：Ｓ９７７６７５）から入手することができる。
【００４４】
式（ＩＩＩ）で示される化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよく、適宜慣用の合成法を組み合わせて合成してもよいし、市販のものであってもよい。
【００４５】
式（ＩＩＩ）で示される化合物としては、特に、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−フェノキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５，６−トリヒドロキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−メトキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、６−ベンジルオキシ−２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−６−エトキシ−４，５−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−イソプロポキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−イソブトキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−プロポキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−（２−メチルプロペニルオキシ）−１，２−ジヒドロインドール−３−オンが好ましい。
【００４６】
式（ＩＩＩ）で示される化合物は、例えば、以下のような合成スキームによって得ることができる。なお、各合成スキーム中の記号の定義は上述のとおりである。
【００４７】
化合物Ａから、例えば、Ｒ．Ｍ．Ａｃｈｅｓｏｎ：「複素環化合物の化学」，科学技術出版社，ｐｐ２１２−２１３の記載に従い、化合物Ｂを得る。
【００４８】
【化１１】
化合物Ｂをアセチル化して化合物Ｃを得る。その後、化合物Ｃを、化合物Ｄと、例えば、Ｂｕｚａｓ，Ａ．；Ｍｅｒｏｕｒ，Ｊ．Ｙ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８９，４５８−４６１の記載に従って反応させることによって、化合物（ＩＩＩ）が得られる。
【００４９】
【化１２】
【００５０】
本発明のスクリーニング方法は例えば以下のようにして行うことができる。
ファーマコフォア定義
【００５１】
【化１３】
を満たす化合物を選択し、慣用のドッキングプログラムを用いてＧＬＯ Ｉの立体構造と該化合物の結合スコアを計算し、結合スコアの良好な化合物のＧＬＯ Ｉ活性阻害活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する。ここで用いられるドッキングプログラムは、特に限定されず、当分野で一般的に利用可能なソフトウェアを用いればよく、そのようなソフトウェアとしては、例えば、ＤＯＣＫ、ＡＵＴＯＤＯＣＫなどが挙げられるが、結晶構造中の阻害剤（ＰＤＢコード１ＱＩＮ）のＺｎ２＋との配位座標を基にファーマコフォア定義を満たす化合物をそれに重ね合わせ複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場［Ｗ．Ｄ．Ｃｏｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，５１７９−５１９７（１９９５）］を用いて構造最適化を行い、得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラムが好ましい。ｉｎ ｖｉｔｒｏの評価としては、例えば、酵素反応生成物の吸光度の測定、既存の阻害剤に蛍光色素を付加した分子を利用した蛍光偏光測定などが挙げられる。
このようにして、ＧＬＯ Ｉ活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。
【００５２】
本発明におけるＧＬＯ Ｉ活性阻害活性とは、例えば、酵素反応生成物の吸光度の測定や既存の阻害剤に蛍光色素を付加した分子を利用した蛍光偏光測定などのＧＬＯ Ｉ活性を評価可能な方法を用いて評価した場合に、コントロールに比べて有意にＧＬＯ Ｉ活性を阻害する活性を意味し、１００μＭでの％阻害が１０％以上であるのが好ましく、３０％以上であるのがさらに好ましい。
【００５３】
また、本発明におけるアポトーシス誘導活性とは、例えば、ＭＴＴアッセイなどの細胞の増殖を評価可能な方法を用いて評価した場合に、コントロールに比べて有意にアポトーシスを誘導する活性を意味し、ＥＣ５０が３０μＭ以下であるのが好ましく、２０μＭ以下であるのがさらに好ましい。
【００５４】
本発明の薬剤を医薬として使用する場合、上記ファーマコフォアまたは式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで示される化合物（以下これらを総称して本発明の化合物ともいう）の少なくとも１種を、医薬上許容される担体（例えば、賦形剤、希釈剤等）などの必要な成分と適宜混合し、液状製剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、エアロゾル剤等の慣用の任意の剤形に製剤化して、経口的または非経口的に投与することができる。
【００５５】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリジン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラバン、プロピルパラバン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００５６】
好ましくは、本発明の薬剤は、経口または注射製剤である。好適な経口製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の本発明の化合物を溶解させた液剤、有効量の該化合物を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の該化合物を懸濁させた懸濁液剤、有効量の該化合物を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００５７】
好適な注射製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。本発明の製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、本発明の化合物および医薬上許容される担体を凍結乾燥（フリーズドライ）し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００５８】
本発明の薬剤の投与量は、有効成分である本発明の化合物の有効量、該化合物の細胞毒性、病気の進行度、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり３０μｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは３００μｇ〜３ｍｇ／ｋｇ体重であり、この量を１回または数回に分けて投与することができる。
【実施例】
【００５９】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００６０】
ＧＬＯ Ｉ活性阻害活性を有する化合物の同定
基質の遷移状態を基に以下のファーマコフォア定義１を構築した。
【００６１】
【化１４】
【００６２】
予め構築しておいた化合物ライブラリよりファーマコフォア定義１を有する化合物を選択し、選択した化合物をドッキングプログラム（結晶構造中の阻害剤（ＰＤＢコード１ＱＩＮ）のＺｎ２＋との配位座標を基にファーマコフォア定義を満たす化合物をそれに重ね合わせ複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場［Ｗ．Ｄ．Ｃｏｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，５１７９−５１９７（１９９５）］を用いて、構造最適化を行い得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラム）を用いてスクリーニングした。スクリーニングした化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し（ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価方法は後述）、後述の化合物１〜１４を同定した。このｉｎ ｖｉｔｒｏ評価の結果を基に、さらに以下のファーマコフォア定義２を構築した。
【００６３】
【化１５】
【００６４】
化合物ライブラリよりファーマコフォア定義２を有する化合物を選択した。選択した化合物をドッキングプログラム（結晶構造中の阻害剤（ＰＤＢコード１ＱＩＮ）のＺｎ２＋との配位座標を基にファーマコフォア定義を満たす化合物をそれに重ね合わせ複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場［Ｗ．Ｄ．Ｃｏｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，５１７９−５１９７（１９９５）］を用いて、構造最適化を行い、得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラム）を用いてスクリーニングした。スクリーニングした化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し（ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価方法は後述）、後述の化合物１５〜１８を同定した。
【００６５】
ファーマコフォア定義２を元に以下の製造例１〜９の化合物をモデリングした。製造例１〜９の化合物は以下の合成スキームに従って作製できる。
【００６６】
製造例１：２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−フェノキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オンの合成
２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−フェノキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オンは以下の合成スキームに従って作製することができる。
【００６７】
工程１
メチル ３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（アルドリッチ社製）から、Ｓｃｈｅｌｉｎｅ，Ｒ．Ｒ． Ａｃｔａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，１９６６，２０，１１８２の記載に準じ、メチル ３，４−ジヒドロキシ−５−フェノキシベンゾエートを得る。メチル ３，４−ジヒドロキシ−５−フェノキシベンゾエートから、Ｓｈａｉｒ，Ｍ．Ｄ．；Ｙｏｏｎ，Ｔ．Ｙ．；Ｍｏｓｎｙ，Ｋ．Ｋ．；Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．；Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８，９５０９の記載に準じ、メチル ７−フェノキシ−２，２−ジフェニルベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレートを得る。
【００６８】
【化１６】
【００６９】
工程２
工程１で得られたメチル ７−フェノキシ−２，２−ジフェニルベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレートのカルボキシ基を脱保護し、Ｓｔｏｃｋｅｌ，Ｒ．Ｆ．；Ｈａｌｌ，Ｄ．Ｍ． Ｎａｔｕｒｅ，１９６３，１９７，７８７に記載の方法に準じ、５−アミノ−３−フェノキシベンゼン−１，２−ジオールを得る。５−アミノ−３−フェノキシベンゼン−１，２−ジオールから、Ｐａｑｕｅｔ，Ａ． Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１９８２，６０，９７６の記載に準じ、９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル （３，４−ジヒドロキシ−５−フェノキシフェニル）カルバメートを得る。９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル （３，４−ジヒドロキシ−５−フェノキシフェニル）カルバメートのアミノ基を脱保護し、Ｓｈａｉｒ，Ｍ．Ｄ．；Ｙｏｏｎ，Ｔ．Ｙ．；Ｍｏｓｎｙ，Ｋ．Ｋ．；Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．；Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８，９５０９の記載に準じ、７−フェノキシ−２，２−ジフェニルベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミンを得る。
【００７０】
【化１７】
【００７１】
工程３
工程２で得られた７−フェノキシ−２，２−ジフェニルベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミンから、Ｒ．Ｍ．Ａｃｈｅｓｏｎ 「複素環化合物の化学」，科学技術出版社，ｐｐ２１２−２１３の記載に準じ、４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンを得る。４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンをアセチル化して、６−アセチル−４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンを得る。
【００７２】
【化１８】
【００７３】
工程４
工程３で得られた６−アセチル−４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンと３，４−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシラニルオキシ）−ベンズアルデヒド〔Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｒｅｎｎｉｓｏｎ，Ｄ．；ＭｃＧｏｗｎ，Ａ．Ｔ．；Ｈａｄｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａ． Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００３，１３，３７５９−３７６３．〕から、Ｂｕｚａｓ，Ａ．；Ｍｅｒｏｕｒ，Ｊ．Ｙ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８９，４５８−４６１の記載に準じ、６−アセチル−７−［３，４−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ベンジリデン］−４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンを得る。
【００７４】
【化１９】
【００７５】
工程５
工程４で得られた６−アセチル−７−［３，４−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ベンジリデン］−４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンを脱保護して、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−フェノキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オンを得る。
【００７６】
【化２０】
【００７７】
製造例２〜９
以下の製造例２〜９の化合物は、製造例１の合成スキームに準じ、作製することができる。
【００７８】
【表１】
【００７９】
同定化合物の活性の測定
同定化合物のグリオキサラーゼＩ阻害活性およびアポトーシス誘導活性を以下に記載の手順により測定した。測定に使用した化合物は、実施例１の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｌ９２８３）、実施例２の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（４６５１１９）、実施例３の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｒ５１３３７７）、実施例４の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（４６０７４５）、実施例５の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｑ０１２５）、実施例６の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｋ０１３３）、実施例８の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（１７７９９）、実施例９の化合物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ａ８２０６）、実施例１４の化合物は、Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ社（フランス）、実施例１５の化合物はＲａｒｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ社（ＢＢＲＢ１５７２）、実施例１６の化合物はＴｉｍｔｅｃ社（ＳＴ２０９８１７）、実施例１７の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓ７６０６８４）、実施例１８の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓ９７７６７５）より購入し、実施例７、１０、１１、１２、１３の化合物は上述したような方法にて天然物から抽出した。
【００８０】
グリオキサラーゼＩ活性阻害試験
化合物１〜１８のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるグリオキサラーゼＩ活性の阻害能を以下の手順で評価した。
ＨＬ−６０細胞（ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を３ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（−）に溶解して凍結融解を３回行い、２０，０００ｇで１５分間遠心してその上清を細胞質画分として化合物の評価に用いた。
化合物の評価は、最終濃度として１００μｇ／ｍＬの細胞質タンパク，７．９ｍＭのメチルグリオキサール，１ｍＭのグルタチオン，１４．６ｍＭの硫酸マグネシウム，１８２ｍＭのイミダゾール−塩酸（ｐＨ７．０）を含む溶液中で行った。化合物０、１、３、１０、３０、１００μＭ存在下、酵素反応生成物であるＳ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンがもつ２４０ｎｍの吸光度を５分間測定し、各化合物の１００μＭでの％阻害およびＩＣ５０を以下の式により算出した。
【００８１】
【数１】
【００８２】
上記の式で各濃度における％阻害を算出し、Ｘ軸に化合物濃度の対数、Ｙ軸に％阻害をとったグラフを作成し、５０％阻害に対応する濃度をＩＣ５０とした。
【００８３】
アポトーシス誘導活性試験
化合物のアポトーシス誘導活性を確認するために、生存細胞のミトコンドリアが黄色のテトラゾリウム成分（ＭＴＴ）を不溶性の紫色ホルマザン生成物に還元することを利用した比色測定法（ＭＴＴアッセイ）を実施した。
２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製したＨＬ−６０細胞（ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を、９６ウェルプレートに１００μｌずつ分注し、各化合物を０、１、３、１０、３０、１００μＭになるように添加した。バックグラウンド測定のために、細胞の代わりに細胞培養液を分注したウェルを用意し、同様に各化合物を添加した。これらをＣＯ２インキュベータ内で２４時間インキュベートした。各ウェルに、０．５％ ＭＴＴ−ＰＢＳ溶液を１１μｌ添加し、ＣＯ２インキュベータ内で１時間インキュベートした。１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、ジメチルスルホキシドを１００μｌ添加した。マイクロプレートリーダーで５７５ｎｍの吸光度を測定し、以下のようにしてＥＣ５０を算出した。
細胞を分注したウェルについて測定した吸光度から、細胞培養液を分注したウェルについて測定した吸光度をバックグラウンドとして引いた。この値をＹ軸に、化合物濃度の対数をＸ軸にとったグラフを作成し、化合物（−）のＹ値の５０％の値に対応する化合物濃度をＥＣ５０とした。
【００８４】
試験結果
グリオキサラーゼＩ活性阻害試験およびアポトーシス誘導活性試験の結果を使用した化合物１〜１８の構造式とともに下記の表に示す。
【００８５】
【表２−１】
【００８６】
【表２−２】
【００８７】
【表２−３】
【００８８】
これらの結果から、本発明の阻害剤は、優れたグリオキサラーゼＩ活性阻害活性およびアポトーシス誘導活性を有することがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】グリオキサラーゼＩの４つの結合ポケット（Ｓ１〜Ｓ４）と、グリオキサラーゼＩ活性阻害活性を有する化合物のファーマコフォアとの関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なグリオキサラーゼＩ活性阻害剤に関する。さらに詳細には、本発明はグリオキサラーゼＩ活性を阻害するアポトーシス誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリオキサラーゼＩ（ＧＬＯ Ｉ）は、メチルグリオキサール（ＭＧ）とグルタチオン（ＧＳＨ）からＳ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンを生成させる酵素である。その後、Ｓ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンはグリオキサラーゼＩＩ（ＧＬＯ ＩＩ）により乳酸へと代謝される（式１参照）。ＭＧは解糖系の代謝副産物であるが、反応性の高いジカルボニル化合物であることから、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡを非可逆的に修飾し、細胞死（アポトーシス）を誘発する。よって、ＧＬＯ Ｉは細胞内で毒性の強いＭＧを乳酸へと無毒化する役割を担っている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
これまでの研究では、ＧＬＯ Ｉは大腸及び前立腺癌細胞等に過剰に発現しており、また、抗癌剤に耐性を示す細胞株においても高発現していることが報告されている（非特許文献１〜３）。以上のことから、ＧＬＯ Ｉ活性を阻害する薬剤は、癌細胞にＭＧを蓄積させ、アポトーシスを誘導するという新しいタイプの抗癌剤として注目されており、これまでにいくつかのＧＳＨ類縁体が開発されている（非特許文献４）。
しかしながら、ＧＳＨ誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては強いＧＬＯ Ｉ阻害活性を示すが、ＧＳＨが持つペプチド骨格、特に負電荷を持つ２つのカルボキシル基（式２参照）が膜透過性、吸収性、安定性に影響を与え、医薬品のリード化合物としては不適切であると考えられている。
【０００５】
【化２】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＳＤ， Ｃｈｅｒｒｙ ＪＰ， Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ＭＳ， Ｔａｚａｋｉ Ｈ， Ｍａｌｌｏｕｈ Ｃ， Ｋｏｎｎｏ Ｓ． Ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ Ｕｒｏｌ． （１９９９） １６１， ６９０−６９１
【非特許文献２】Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ Ｓ， Ｗａｌｓｈ ＥＳ， Ｔｅｗ ＫＤ． Ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ ｉｎ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ： ｓｔｕｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． （１９９５） ３０９， １２７−１３１
【非特許文献３】Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ， Ｍａｓｈｉｍａ Ｔ， Ｋｉｚａｋｉ Ａ， Ｄａｎ Ｓ， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｙ， Ｎａｉｔｏ Ｍ， Ｔｓｕｒｕｏ Ｔ． Ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｂｌｏｏｄ． （２０００） ９， ３２１４−３２１８
【非特許文献４】Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ ＤＪ， Ｚｈｅｎｇ ＺＢ， Ｈｏｌｅｗｉｎｓｋｉ Ｒ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＤＳ， Ｅｉｓｅｍａｎ ＪＬ． Ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ． （２００３） ３１， １３７８−１３８２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような背景から本発明者らは、ＧＬＯ Ｉ活性阻害剤としてＧＳＨを基本骨格として有していない新規な低分子化合物が必要とされていると考え、ＧＬＯ Ｉ活性を阻害しかつ上記問題点を改善可能なアポトーシス誘導剤を提供することを本発明の目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、ＧＬＯ Ｉの特定の４つの結合ポケット（図１、Ｓ１〜Ｓ４）との結合領域を有する化合物がＧＬＯ Ｉ活性を有意に阻害しかつアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。なお、ファーマコフォアの定義においては通常の構造式の結合は破線で示してある。
（１） 以下のファーマコフォア
【０００８】
【化３】
【０００９】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、あるいは、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕
を有する化合物またはその配糖体を少なくとも一種含有する、グリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
（２） 以下の式（Ｉ−ａ）または（Ｉ−ｂ）
【００１０】
【化４】
【００１１】
〔式中、Ｒ１１はＣ１−６アルコキシまたは水素であり；Ｒ１２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ１４はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、水素またはハロゲンであり；Ｒ１８は、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシまたは水素であり；点線部は任意で単結合であり、点線部に単結合がある場合、Ｘ１は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ１９−（Ｒ１９は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基であり、点線部に結合が存在しない場合、Ｘ１は水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｘ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ１９−（Ｒ１９は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基である〕で示される化合物、および
式（ＩＩ）
【００１２】
【化５】
【００１３】
〔式中、Ｒ２１はオキソ、アリールまたは水素であり；Ｒ２２はアリール、含窒素複素環基、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アリール−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルまたは水素であるか；またはＲ２１とＲ２２は各基が結合する５員環上の原子と一緒になって、芳香族環、Ｃ３−６シクロアルカン、Ｃ３−６シクロアルケンを形成し；Ｒ２３はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ２４は置換されていてもよいアリールであり；Ｙ、Ｚは独立してそれぞれ窒素または炭素であり；Ｗは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＣＨ２−、−ＮＲ２５−（Ｒ２５は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基であるか、または結合であるか、あるいはＺが炭素であるときＷが＝ＣＨ−であり；
【００１４】
【化６】
【００１５】
は、Ｙ、Ｚ、Ｗの種類に依存して単結合もしくは二重結合を示す〕で示される化合物、ならびに
それらの配糖体からなる群から選択される化合物を含有する、グリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
（３） Ｒ１２がヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、またはＣ１−６アルキル−カルボキシであり；Ｒ１３がヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシまたは水素であり；Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７がそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリルまたは水素であり；点線部が単結合である場合、Ｘ１が−Ｏ−であり、点線部に結合が存在しない場合、Ｘ１が水素であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；
Ｒ２２がアリール、アリール−Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６アルコキシ−カルボニルであるか、またはＲ２１とＲ２２が各基が結合する５員環上の原子と一緒になって、Ｃ３−６シクロアルケンを形成し；Ｒ２３がヒドロキシであり；Ｙが炭素であり；Ｚが窒素でありかつＷが−ＣＨ２−または結合であるか、あるいはＺが炭素でありかつＷが＝ＣＨ−である、上記（２）に記載のグリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
（４） アポトーシス誘導剤である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のグリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
（５） 以下の式（ＩＩＩ）
【００１６】
【化７】
【００１７】
〔Ｒ３１はヒドロキシ、アリール、アリールオキシ、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルケニルオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ３３はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、水素またはハロゲンである〕で示される化合物またはその配糖体。
（６） Ｒ３１がヒドロキシ、アリールオキシ、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシまたはＣ１−６アルケニルオキシであり；Ｒ３２がヒドロキシであり；Ｒ３３がヒドロキシであり；Ｒ３４、Ｒ３５およびＲ３６のいずれか１つが水素であり、残りの２つがヒドロキシである、上記（５）に記載の化合物またはその配糖体。
（７） Ｒ３１がアリールオキシである、上記（６）に記載の化合物またはその配糖体。
（８） 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【００１８】
【化８】
【００１９】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、グリオキサラーゼＩ活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
（９） 被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【００２０】
【化９】
【００２１】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕に合致するかどうかを調べる工程と
合致した化合物のグリオキサラーゼＩ活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【００２２】
以下の説明において、上記ファーマコフォアを有する化合物、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで示される化合物を総合してＧＬＯ Ｉ活性阻害化合物とも表し、また、該化合物またはその配糖体を含有するＧＬＯ Ｉ阻害剤およびアポトーシス誘導剤を単に本発明の薬剤と表することもある。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の薬剤は、ＧＬＯ Ｉ阻害剤としては新規な骨格を有する化合物を有効成分とするため、従来のＧＳＨ誘導体に見られるようなＧＳＨが持つペプチド骨格、特に負電荷を持つ２つのカルボキシル基による膜透過性、吸収性、安定性への影響がない点で有用であり、医薬品のリード化合物としてもＧＳＨ誘導体よりも適切である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本明細書におけるＣ１−６アルキルとは、炭素数１〜６の直鎖または分枝のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘキシルなどが挙げられる。
本明細書におけるＣ１−６アルコキシとは、炭素数１〜６の直鎖または分枝のアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ、ｔｅｒｔ−ヘキシルオキシなどが挙げられる。
本明細書におけるＣ１−６アルケニルとは、炭素数１〜６の直鎖または分枝のアルケニル基を意味し、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキサニレンなどが挙げられる。
本明細書におけるハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などが挙げられる。
本明細書におけるアリールとは、１〜３員の芳香族基を意味し、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニルなどが挙げられる。
本明細書における置換されていてもよいアリールの置換基としては、例えば、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロおよびハロゲンが挙げられるが、なかでもニトロおよびハロゲンが好ましい。
本明細書における含窒素複素環基とは、少なくとも１つ以上の窒素原子を環構成原子として含む単環系または縮合環系の複素環基を意味し、例えば、ピロリニル、イミダゾリニル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリジニル、カルバゾリニルなどが挙げられる。
本明細書における芳香族環とは、単環系および縮合環系の芳香族環を意味し、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセンなどが挙げられる。
本明細書におけるＣ３−６シクロアルカンとは、炭素数３〜６の脂肪族シクロアルカンを意味し、例えば、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサンなどが挙げられる。
本明細書におけるＣ３−６シクロアルケンとは、炭素数３〜６の脂肪族シクロアルケンを意味し、例えば、シクロプロペン、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセンなどが挙げられる。
本明細書における置換されていてもよいアリルの置換基としては、置換されていてもよいアリールの置換基として例示したようなものが挙げられるが、なかでもＣ１−６アルキルが好ましい。
【００２５】
Ｒ１としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）または水素が好ましい。
Ｒ２としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）、アリール（特にフェニル）またはＣ１−６アルキル−カルボキシ（特にメチルカルボキシ）が好ましい。
Ｒ３としては、−Ｏ−または水素が好ましい。
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）、ハロゲン（特に塩素）、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ（特にメチルカルボキシ）、置換されていてもよいアリル（特に１，１−ジメチルアリル）、ニトロまたは水素が好ましい。
Ｒ１１としては、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）または水素が好ましい。
Ｒ１２としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）またはＣ１−６アルキル−カルボキシ（特にメチルカルボキシ）が好ましい。
Ｒ１３としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）または水素が好ましい。
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７としては、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ（特にメトキシ）、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ（特にメチルカルボキシ）、置換されていてもよいアリル（特に１，１−ジメチルアリル）または水素が好ましい。
Ｘ１としては、点線部が単結合である場合、−Ｏ−が好ましく、点線部に結合が存在しない場合、水素が好ましい。
Ｘ２としては、−Ｏ−が好ましい。
Ｒ２２としては、アリール（特にフェニル）、アリール−Ｃ１−６アルキル（特にフェニルメチル）またはＣ１−６アルコキシ−カルボニル（特にエトキシカルボニル）が好ましい。
また、Ｒ２１とＲ２２が、各基が結合する５員環上の原子と一緒になって、シクロヘキセンを形成するのも好ましい。
Ｒ２３としては、ヒドロキシが好ましい。
Ｒ２４としては、フェニル、クロロフェニルまたはクロロニトロフェニルが好ましい。
Ｙとしては、炭素が好ましい。
Ｚが窒素であるときＷとしては−ＣＨ２−または結合が好ましく、Ｚが炭素であるときＷとしては＝ＣＨ−が好ましい。
Ｒ３１としては、ヒドロキシ、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ（特にメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、フェノキシ、フェニルメトキシ）、Ｃ１−６アルケニルオキシ（特に２−メチルプロペニルオキシ）が好ましい。
Ｒ３２としては、ヒドロキシが好ましい。
Ｒ３３としては、ヒドロキシが好ましい。
Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６としては、ヒドロキシまたは水素が好ましい。
【００２６】
本発明の薬剤の有効成分として用いる化合物としては、下記の式で表されるフラボン骨格、カルコン骨格、オーロン骨格を有する化合物、および上述の式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）で示される化合物、ならびにそれらの配糖体が好ましい。
【００２７】
【化１０】
【００２８】
フラボン骨格を有する化合物としては、特に、ルテオリン、バイカレイン、３−ａｃｏ−２−（３，４−ジアセトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル酢酸、アピゲニン、ケルセチン、ケンフェロール、オロキシリンＡ、ラムネチン、アカセチン、オウゴニンが好ましい。
【００２９】
フラボン骨格を有する化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよいが、例えば、マメ科、アヤメ科、バラ科等に属する植物から、慣用の抽出精製方法を用いて遊離化合物または配糖体として得ることができる。
【００３０】
例えば、オロキシリンＡおよびオウゴニンは、以下のようにして得ることができる。
オウゴン（４５０ｇ）をエタノールで抽出し、得られたエタノールエキスに水を加え、エチルエーテルで分配する。エーテル層をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０を担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ベンゼン−アセトンの混液で溶出させ、３画分（ｆｒ．１、ｆｒ．２、ｆｒ．３）を得る。このうちｆｒ．１をさらにシリカゲルを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ベンゼンで溶出させ、オロキシリンＡ（２０ｍｇ）およびオウゴニン（４０ｍｇ）を得る。
【００３１】
また、天然に見出されていない本発明のフラボン骨格を有する化合物については、例えば、天然から単離され得るフラボン骨格を有する化合物を、慣用の方法を用いて改変することにより調製することができる。
【００３２】
カルコン骨格を有する化合物としては、特に、３，４，４’，６’−テトラヒドロキシ−６−メトキシカルコン、リコカルコンＡ、リコカルコンＢが好ましい。
【００３３】
カルコン骨格を有する化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよいが、例えば、キク科植物等から、慣用の抽出精製方法を用いて遊離化合物または配糖体として得ることができる。
【００３４】
例えば、リコカルコンＡおよびＢは、市販の新彊産甘草を７０％含水アセトン中でホモジナイズし、遠沈で不溶物を除いた後、上清の濃縮物をエーテルと水で分配、エーテルエキスについて遠心向流分配クロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール−水７：１３：８；下降法）およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール９８：２で溶出）を組み合わせて分離することにより、それぞれ黄色結晶として得ることができる。
【００３５】
また、３，４，４’，６’−テトラヒドロキシ−６−メトキシカルコンは、例えば、東北甘草を上記と同様含水アセトン抽出し、そのエーテルエキスについて液滴向流分配クロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール−プロパノール−水４５：６０：１０：４０；下降法）、ＭＣＩ−ゲル ＣＨＰ−２０Ｐを吸着剤とするカラムクロマトグラフィー（含水メタノールで溶出）およびシリカゲル薄層での分取クロマトグラフィーを組み合わせて分離することにより、リコカルコンＢ、グリシクマリンとともに、黄色結晶として得ることができる。
【００３６】
また、天然に見出されていない本発明のカルコン骨格を有する化合物については、例えば、天然から単離され得るカルコン骨格を有する化合物を、慣用の方法を用いて改変することにより調製することができる。
【００３７】
オーロン骨格を有する化合物としては、特に、スルフレチンが好ましい。
【００３８】
オーロン骨格を有する化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよいが、例えば、キク科植物等から、慣用の抽出精製方法を用いて遊離化合物または配糖体として得ることができる。
【００３９】
例えば、スルフレチンは、Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ社（フランス）から入手することができる。
【００４０】
また、天然に見出されていない本発明のオーロン骨格を有する化合物については、例えば、天然から単離され得るオーロン骨格を有する化合物を、慣用の方法を用いて改変することにより調製することができる。
【００４１】
式（ＩＩ）で示される化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよく、適宜慣用の合成法を組み合わせて合成してもよいし、市販のものであってもよい。
【００４２】
式（ＩＩ）で示される化合物としては、特に、２−（４−クロロ−３−ニトロベンジリデン）−４−ヒドロキシ−５−フェニルシクロペント−４−エン−１，３−ジオン、１，４−ジベンジル−３−ヒドロキシ−１Ｈ−ピロール−２（５Ｈ）−オン、１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−２，４，５，６−テトラヒドロ−２−インドロン、エチル ４−ヒドロキシ−５−オキソ−１，２−ジフェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−カルボキシレートが好ましい。
【００４３】
式（ＩＩ）で示される化合物のうち好ましい化合物は、例えば、２−（４−クロロ−３−ニトロベンジリデン）−４−ヒドロキシ−５−フェニルシクロペント−４−エン−１，３−ジオンはＲａｒｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ社（カタログナンバー：ＢＢＲＢ１５７２）、１，４−ジベンジル−３−ヒドロキシ−１Ｈ−ピロール−２（５Ｈ）−オンはＴｉｍＴｅｃ社（カタログナンバー：ＳＴ２０９８１７）、１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシ−２，４，５，６−テトラヒドロ−２−インドロンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（カタログナンバー：Ｓ７６０６８４）、エチル ４−ヒドロキシ−５−オキソ−１，２−ジフェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−カルボキシレートはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（カタログナンバー：Ｓ９７７６７５）から入手することができる。
【００４４】
式（ＩＩＩ）で示される化合物はいかなる方法によって得られるものであってもよく、適宜慣用の合成法を組み合わせて合成してもよいし、市販のものであってもよい。
【００４５】
式（ＩＩＩ）で示される化合物としては、特に、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−フェノキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５，６−トリヒドロキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−メトキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、６−ベンジルオキシ−２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−６−エトキシ−４，５−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−イソプロポキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−イソブトキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−プロポキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オン、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−（２−メチルプロペニルオキシ）−１，２−ジヒドロインドール−３−オンが好ましい。
【００４６】
式（ＩＩＩ）で示される化合物は、例えば、以下のような合成スキームによって得ることができる。なお、各合成スキーム中の記号の定義は上述のとおりである。
【００４７】
化合物Ａから、例えば、Ｒ．Ｍ．Ａｃｈｅｓｏｎ：「複素環化合物の化学」，科学技術出版社，ｐｐ２１２−２１３の記載に従い、化合物Ｂを得る。
【００４８】
【化１１】
化合物Ｂをアセチル化して化合物Ｃを得る。その後、化合物Ｃを、化合物Ｄと、例えば、Ｂｕｚａｓ，Ａ．；Ｍｅｒｏｕｒ，Ｊ．Ｙ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８９，４５８−４６１の記載に従って反応させることによって、化合物（ＩＩＩ）が得られる。
【００４９】
【化１２】
【００５０】
本発明のスクリーニング方法は例えば以下のようにして行うことができる。
ファーマコフォア定義
【００５１】
【化１３】
を満たす化合物を選択し、慣用のドッキングプログラムを用いてＧＬＯ Ｉの立体構造と該化合物の結合スコアを計算し、結合スコアの良好な化合物のＧＬＯ Ｉ活性阻害活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する。ここで用いられるドッキングプログラムは、特に限定されず、当分野で一般的に利用可能なソフトウェアを用いればよく、そのようなソフトウェアとしては、例えば、ＤＯＣＫ、ＡＵＴＯＤＯＣＫなどが挙げられるが、結晶構造中の阻害剤（ＰＤＢコード１ＱＩＮ）のＺｎ２＋との配位座標を基にファーマコフォア定義を満たす化合物をそれに重ね合わせ複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場［Ｗ．Ｄ．Ｃｏｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，５１７９−５１９７（１９９５）］を用いて構造最適化を行い、得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラムが好ましい。ｉｎ ｖｉｔｒｏの評価としては、例えば、酵素反応生成物の吸光度の測定、既存の阻害剤に蛍光色素を付加した分子を利用した蛍光偏光測定などが挙げられる。
このようにして、ＧＬＯ Ｉ活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。
【００５２】
本発明におけるＧＬＯ Ｉ活性阻害活性とは、例えば、酵素反応生成物の吸光度の測定や既存の阻害剤に蛍光色素を付加した分子を利用した蛍光偏光測定などのＧＬＯ Ｉ活性を評価可能な方法を用いて評価した場合に、コントロールに比べて有意にＧＬＯ Ｉ活性を阻害する活性を意味し、１００μＭでの％阻害が１０％以上であるのが好ましく、３０％以上であるのがさらに好ましい。
【００５３】
また、本発明におけるアポトーシス誘導活性とは、例えば、ＭＴＴアッセイなどの細胞の増殖を評価可能な方法を用いて評価した場合に、コントロールに比べて有意にアポトーシスを誘導する活性を意味し、ＥＣ５０が３０μＭ以下であるのが好ましく、２０μＭ以下であるのがさらに好ましい。
【００５４】
本発明の薬剤を医薬として使用する場合、上記ファーマコフォアまたは式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで示される化合物（以下これらを総称して本発明の化合物ともいう）の少なくとも１種を、医薬上許容される担体（例えば、賦形剤、希釈剤等）などの必要な成分と適宜混合し、液状製剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、エアロゾル剤等の慣用の任意の剤形に製剤化して、経口的または非経口的に投与することができる。
【００５５】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリジン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラバン、プロピルパラバン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００５６】
好ましくは、本発明の薬剤は、経口または注射製剤である。好適な経口製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の本発明の化合物を溶解させた液剤、有効量の該化合物を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の該化合物を懸濁させた懸濁液剤、有効量の該化合物を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００５７】
好適な注射製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。本発明の製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、本発明の化合物および医薬上許容される担体を凍結乾燥（フリーズドライ）し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００５８】
本発明の薬剤の投与量は、有効成分である本発明の化合物の有効量、該化合物の細胞毒性、病気の進行度、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり３０μｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは３００μｇ〜３ｍｇ／ｋｇ体重であり、この量を１回または数回に分けて投与することができる。
【実施例】
【００５９】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００６０】
ＧＬＯ Ｉ活性阻害活性を有する化合物の同定
基質の遷移状態を基に以下のファーマコフォア定義１を構築した。
【００６１】
【化１４】
【００６２】
予め構築しておいた化合物ライブラリよりファーマコフォア定義１を有する化合物を選択し、選択した化合物をドッキングプログラム（結晶構造中の阻害剤（ＰＤＢコード１ＱＩＮ）のＺｎ２＋との配位座標を基にファーマコフォア定義を満たす化合物をそれに重ね合わせ複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場［Ｗ．Ｄ．Ｃｏｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，５１７９−５１９７（１９９５）］を用いて、構造最適化を行い得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラム）を用いてスクリーニングした。スクリーニングした化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し（ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価方法は後述）、後述の化合物１〜１４を同定した。このｉｎ ｖｉｔｒｏ評価の結果を基に、さらに以下のファーマコフォア定義２を構築した。
【００６３】
【化１５】
【００６４】
化合物ライブラリよりファーマコフォア定義２を有する化合物を選択した。選択した化合物をドッキングプログラム（結晶構造中の阻害剤（ＰＤＢコード１ＱＩＮ）のＺｎ２＋との配位座標を基にファーマコフォア定義を満たす化合物をそれに重ね合わせ複合体モデルを作成し、その後、ＡＭＢＥＲ力場［Ｗ．Ｄ．Ｃｏｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，５１７９−５１９７（１９９５）］を用いて、構造最適化を行い、得られるエネルギーを結合親和性スコアとして計算するプログラム）を用いてスクリーニングした。スクリーニングした化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し（ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価方法は後述）、後述の化合物１５〜１８を同定した。
【００６５】
ファーマコフォア定義２を元に以下の製造例１〜９の化合物をモデリングした。製造例１〜９の化合物は以下の合成スキームに従って作製できる。
【００６６】
製造例１：２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−フェノキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オンの合成
２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−フェノキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オンは以下の合成スキームに従って作製することができる。
【００６７】
工程１
メチル ３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（アルドリッチ社製）から、Ｓｃｈｅｌｉｎｅ，Ｒ．Ｒ． Ａｃｔａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，１９６６，２０，１１８２の記載に準じ、メチル ３，４−ジヒドロキシ−５−フェノキシベンゾエートを得る。メチル ３，４−ジヒドロキシ−５−フェノキシベンゾエートから、Ｓｈａｉｒ，Ｍ．Ｄ．；Ｙｏｏｎ，Ｔ．Ｙ．；Ｍｏｓｎｙ，Ｋ．Ｋ．；Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．；Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８，９５０９の記載に準じ、メチル ７−フェノキシ−２，２−ジフェニルベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレートを得る。
【００６８】
【化１６】
【００６９】
工程２
工程１で得られたメチル ７−フェノキシ−２，２−ジフェニルベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレートのカルボキシ基を脱保護し、Ｓｔｏｃｋｅｌ，Ｒ．Ｆ．；Ｈａｌｌ，Ｄ．Ｍ． Ｎａｔｕｒｅ，１９６３，１９７，７８７に記載の方法に準じ、５−アミノ−３−フェノキシベンゼン−１，２−ジオールを得る。５−アミノ−３−フェノキシベンゼン−１，２−ジオールから、Ｐａｑｕｅｔ，Ａ． Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１９８２，６０，９７６の記載に準じ、９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル （３，４−ジヒドロキシ−５−フェノキシフェニル）カルバメートを得る。９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル （３，４−ジヒドロキシ−５−フェノキシフェニル）カルバメートのアミノ基を脱保護し、Ｓｈａｉｒ，Ｍ．Ｄ．；Ｙｏｏｎ，Ｔ．Ｙ．；Ｍｏｓｎｙ，Ｋ．Ｋ．；Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．；Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８，９５０９の記載に準じ、７−フェノキシ−２，２−ジフェニルベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミンを得る。
【００７０】
【化１７】
【００７１】
工程３
工程２で得られた７−フェノキシ−２，２−ジフェニルベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミンから、Ｒ．Ｍ．Ａｃｈｅｓｏｎ 「複素環化合物の化学」，科学技術出版社，ｐｐ２１２−２１３の記載に準じ、４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンを得る。４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンをアセチル化して、６−アセチル−４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンを得る。
【００７２】
【化１８】
【００７３】
工程４
工程３で得られた６−アセチル−４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンと３，４−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシラニルオキシ）−ベンズアルデヒド〔Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｒｅｎｎｉｓｏｎ，Ｄ．；ＭｃＧｏｗｎ，Ａ．Ｔ．；Ｈａｄｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａ． Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００３，１３，３７５９−３７６３．〕から、Ｂｕｚａｓ，Ａ．；Ｍｅｒｏｕｒ，Ｊ．Ｙ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８９，４５８−４６１の記載に準じ、６−アセチル−７−［３，４−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ベンジリデン］−４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンを得る。
【００７４】
【化１９】
【００７５】
工程５
工程４で得られた６−アセチル−７−［３，４−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ベンジリデン］−４−フェノキシ−２，２−ジフェニル−６，７−ジヒドロ−１，３−ジオキサ−６−アザ−ａｓ−インダセン−８−オンを脱保護して、２−（３，４−ジヒドロキシベンジリデン）−４，５−ジヒドロキシ−６−フェノキシ−１，２−ジヒドロインドール−３−オンを得る。
【００７６】
【化２０】
【００７７】
製造例２〜９
以下の製造例２〜９の化合物は、製造例１の合成スキームに準じ、作製することができる。
【００７８】
【表１】
【００７９】
同定化合物の活性の測定
同定化合物のグリオキサラーゼＩ阻害活性およびアポトーシス誘導活性を以下に記載の手順により測定した。測定に使用した化合物は、実施例１の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｌ９２８３）、実施例２の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（４６５１１９）、実施例３の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｒ５１３３７７）、実施例４の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（４６０７４５）、実施例５の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｑ０１２５）、実施例６の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｋ０１３３）、実施例８の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（１７７９９）、実施例９の化合物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ａ８２０６）、実施例１４の化合物は、Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ社（フランス）、実施例１５の化合物はＲａｒｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ社（ＢＢＲＢ１５７２）、実施例１６の化合物はＴｉｍｔｅｃ社（ＳＴ２０９８１７）、実施例１７の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓ７６０６８４）、実施例１８の化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓ９７７６７５）より購入し、実施例７、１０、１１、１２、１３の化合物は上述したような方法にて天然物から抽出した。
【００８０】
グリオキサラーゼＩ活性阻害試験
化合物１〜１８のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるグリオキサラーゼＩ活性の阻害能を以下の手順で評価した。
ＨＬ−６０細胞（ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を３ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（−）に溶解して凍結融解を３回行い、２０，０００ｇで１５分間遠心してその上清を細胞質画分として化合物の評価に用いた。
化合物の評価は、最終濃度として１００μｇ／ｍＬの細胞質タンパク，７．９ｍＭのメチルグリオキサール，１ｍＭのグルタチオン，１４．６ｍＭの硫酸マグネシウム，１８２ｍＭのイミダゾール−塩酸（ｐＨ７．０）を含む溶液中で行った。化合物０、１、３、１０、３０、１００μＭ存在下、酵素反応生成物であるＳ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンがもつ２４０ｎｍの吸光度を５分間測定し、各化合物の１００μＭでの％阻害およびＩＣ５０を以下の式により算出した。
【００８１】
【数１】
【００８２】
上記の式で各濃度における％阻害を算出し、Ｘ軸に化合物濃度の対数、Ｙ軸に％阻害をとったグラフを作成し、５０％阻害に対応する濃度をＩＣ５０とした。
【００８３】
アポトーシス誘導活性試験
化合物のアポトーシス誘導活性を確認するために、生存細胞のミトコンドリアが黄色のテトラゾリウム成分（ＭＴＴ）を不溶性の紫色ホルマザン生成物に還元することを利用した比色測定法（ＭＴＴアッセイ）を実施した。
２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製したＨＬ−６０細胞（ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を、９６ウェルプレートに１００μｌずつ分注し、各化合物を０、１、３、１０、３０、１００μＭになるように添加した。バックグラウンド測定のために、細胞の代わりに細胞培養液を分注したウェルを用意し、同様に各化合物を添加した。これらをＣＯ２インキュベータ内で２４時間インキュベートした。各ウェルに、０．５％ ＭＴＴ−ＰＢＳ溶液を１１μｌ添加し、ＣＯ２インキュベータ内で１時間インキュベートした。１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、ジメチルスルホキシドを１００μｌ添加した。マイクロプレートリーダーで５７５ｎｍの吸光度を測定し、以下のようにしてＥＣ５０を算出した。
細胞を分注したウェルについて測定した吸光度から、細胞培養液を分注したウェルについて測定した吸光度をバックグラウンドとして引いた。この値をＹ軸に、化合物濃度の対数をＸ軸にとったグラフを作成し、化合物（−）のＹ値の５０％の値に対応する化合物濃度をＥＣ５０とした。
【００８４】
試験結果
グリオキサラーゼＩ活性阻害試験およびアポトーシス誘導活性試験の結果を使用した化合物１〜１８の構造式とともに下記の表に示す。
【００８５】
【表２−１】
【００８６】
【表２−２】
【００８７】
【表２−３】
【００８８】
これらの結果から、本発明の阻害剤は、優れたグリオキサラーゼＩ活性阻害活性およびアポトーシス誘導活性を有することがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】グリオキサラーゼＩの４つの結合ポケット（Ｓ１〜Ｓ４）と、グリオキサラーゼＩ活性阻害活性を有する化合物のファーマコフォアとの関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のファーマコフォア
【化１】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、あるいは、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕
を有する化合物またはその配糖体を少なくとも一種含有する、グリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
【請求項２】
以下の式（Ｉ−ａ）または（Ｉ−ｂ）
【化２】
〔式中、Ｒ１１はＣ１−６アルコキシまたは水素であり；Ｒ１２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ１４はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、水素またはハロゲンであり；Ｒ１８は、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシまたは水素であり；点線部は任意で単結合であり、点線部に単結合がある場合、Ｘ１は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ１９−（Ｒ１９は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基であり、点線部に結合が存在しない場合、Ｘ１は水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｘ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ１９−（Ｒ１９は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基である〕で示される化合物、および
式（ＩＩ）
【化３】
〔式中、Ｒ２１はオキソ、アリールまたは水素であり；Ｒ２２はアリール、含窒素複素環基、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アリール−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルまたは水素であるか；またはＲ２１とＲ２２は各基が結合する５員環上の原子と一緒になって、芳香族環、Ｃ３−６シクロアルカン、Ｃ３−６シクロアルケンを形成し；Ｒ２３はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ２４は置換されていてもよいアリールであり；Ｙ、Ｚは独立してそれぞれ窒素または炭素であり；Ｗは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＣＨ２−、−ＮＲ２５−（Ｒ２５は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基であるか、または結合であるか、あるいはＺが炭素であるときＷが＝ＣＨ−であり；
【化４】
は、Ｙ、Ｚ、Ｗの種類に依存して単結合もしくは二重結合を示す〕で示される化合物、ならびに
それらの配糖体からなる群から選択される化合物を含有する、グリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
【請求項３】
Ｒ１２がヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、またはＣ１−６アルキル−カルボキシであり；Ｒ１３がヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシまたは水素であり；Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７がそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリルまたは水素であり；点線部が単結合である場合、Ｘ１が−Ｏ−であり、点線部に結合が存在しない場合、Ｘ１が水素であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；
Ｒ２２がアリール、アリール−Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６アルコキシ−カルボニルであるか、またはＲ２１とＲ２２が各基が結合する５員環上の原子と一緒になって、Ｃ３−６シクロアルケンを形成し；Ｒ２３がヒドロキシであり；Ｙが炭素であり；Ｚが窒素でありかつＷが−ＣＨ２−または結合であるか、あるいはＺが炭素でありかつＷが＝ＣＨ−である、請求項２に記載のグリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
【請求項４】
アポトーシス誘導剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
【請求項５】
以下の式（ＩＩＩ）
【化５】
〔Ｒ３１はヒドロキシ、アリール、アリールオキシ、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルケニルオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ３３はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、水素またはハロゲンである〕で示される化合物またはその配糖体。
【請求項６】
Ｒ３１がヒドロキシ、アリールオキシ、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシまたはＣ１−６アルケニルオキシであり；Ｒ３２がヒドロキシであり；Ｒ３３がヒドロキシであり；Ｒ３４、Ｒ３５およびＲ３６のいずれか１つが水素であり、残りの２つがヒドロキシである、請求項５に記載の化合物またはその配糖体。
【請求項７】
Ｒ３１がアリールオキシである、請求項６に記載の化合物またはその配糖体。
【請求項８】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化６】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、グリオキサラーゼＩ活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項９】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化７】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕に合致するかどうかを調べる工程と
合致した化合物のグリオキサラーゼＩ活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１】
以下のファーマコフォア
【化１】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、あるいは、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕
を有する化合物またはその配糖体を少なくとも一種含有する、グリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
【請求項２】
以下の式（Ｉ−ａ）または（Ｉ−ｂ）
【化２】
〔式中、Ｒ１１はＣ１−６アルコキシまたは水素であり；Ｒ１２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ１４はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、水素またはハロゲンであり；Ｒ１８は、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシまたは水素であり；点線部は任意で単結合であり、点線部に単結合がある場合、Ｘ１は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ１９−（Ｒ１９は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基であり、点線部に結合が存在しない場合、Ｘ１は水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｘ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ１９−（Ｒ１９は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基である〕で示される化合物、および
式（ＩＩ）
【化３】
〔式中、Ｒ２１はオキソ、アリールまたは水素であり；Ｒ２２はアリール、含窒素複素環基、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アリール−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルまたは水素であるか；またはＲ２１とＲ２２は各基が結合する５員環上の原子と一緒になって、芳香族環、Ｃ３−６シクロアルカン、Ｃ３−６シクロアルケンを形成し；Ｒ２３はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ２４は置換されていてもよいアリールであり；Ｙ、Ｚは独立してそれぞれ窒素または炭素であり；Ｗは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＣＨ２−、−ＮＲ２５−（Ｒ２５は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基であるか、または結合であるか、あるいはＺが炭素であるときＷが＝ＣＨ−であり；
【化４】
は、Ｙ、Ｚ、Ｗの種類に依存して単結合もしくは二重結合を示す〕で示される化合物、ならびに
それらの配糖体からなる群から選択される化合物を含有する、グリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
【請求項３】
Ｒ１２がヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、またはＣ１−６アルキル−カルボキシであり；Ｒ１３がヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシまたは水素であり；Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７がそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリルまたは水素であり；点線部が単結合である場合、Ｘ１が−Ｏ−であり、点線部に結合が存在しない場合、Ｘ１が水素であり；Ｘ２が−Ｏ−であり；
Ｒ２２がアリール、アリール−Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６アルコキシ−カルボニルであるか、またはＲ２１とＲ２２が各基が結合する５員環上の原子と一緒になって、Ｃ３−６シクロアルケンを形成し；Ｒ２３がヒドロキシであり；Ｙが炭素であり；Ｚが窒素でありかつＷが−ＣＨ２−または結合であるか、あるいはＺが炭素でありかつＷが＝ＣＨ−である、請求項２に記載のグリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
【請求項４】
アポトーシス誘導剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリオキサラーゼＩ活性阻害剤。
【請求項５】
以下の式（ＩＩＩ）
【化５】
〔Ｒ３１はヒドロキシ、アリール、アリールオキシ、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルケニルオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ３３はヒドロキシまたは水素であり；Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、水素またはハロゲンである〕で示される化合物またはその配糖体。
【請求項６】
Ｒ３１がヒドロキシ、アリールオキシ、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシまたはＣ１−６アルケニルオキシであり；Ｒ３２がヒドロキシであり；Ｒ３３がヒドロキシであり；Ｒ３４、Ｒ３５およびＲ３６のいずれか１つが水素であり、残りの２つがヒドロキシである、請求項５に記載の化合物またはその配糖体。
【請求項７】
Ｒ３１がアリールオキシである、請求項６に記載の化合物またはその配糖体。
【請求項８】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化６】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕に合致するかどうかを調べる工程と
を含む、グリオキサラーゼＩ活性阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項９】
被験化合物のファーマコフォアを調べる工程と、
該ファーマコフォアが以下のファーマコフォア
【化７】
〔式中、Ｒ１はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、水素またはハロゲンであり；Ｒ２はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、アリールオキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、ハロゲンまたは水素であり；Ｒ３は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−または−ＮＲ８−（Ｒ８は水素またはＣ１−６アルキルである）で示される２価の基、水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、アミノまたはＣ１−６アルキル−カルボニルであり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボキシ、置換されていてもよいアリル、ニトロ、水素またはハロゲンであり；Ｒ７はヒドロキシまたは水素である〕に合致するかどうかを調べる工程と
合致した化合物のグリオキサラーゼＩ活性阻害活性を調べる工程と
を含む、アポトーシス阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−９６６８７（Ｐ２００６−９６６８７Ａ）
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２８２８５５（Ｐ２００４−２８２８５５）
【出願日】平成１６年９月２８日（２００４．９．２８）
【出願人】（５０４３６５１４６）株式会社理論創薬研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２８日（２００４．９．２８）
【出願人】（５０４３６５１４６）株式会社理論創薬研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
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